454平台在PCR产物测序中的应用

        PCR产物测序可以鉴定不同个体中同一个基因的差异,应用最广泛的是宏基因组16S rRNA和18S rRNA测序。16S rRNA和18S rRNA含量大、分子量适中,可以对特定环境下的细菌和古菌群体的微生物种类和丰度进行有效的鉴定。
 
1. 16S/18S PCR产物的测序原理
        原核生物的rRNA分三类:5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA;真核生物的rRNA分四类:5S rRNA、5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。S为大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位,可间接反映分子量的大小。原核生物中,5S含有120个核苷酸,16S含有1540个核苷酸,23S含有2900个核苷酸;而真核生物的4种rRNA分别含有大约120、160、1900和4700个核苷酸。由于16S 和18S PCR产物测序原理相似,所以在此以16S为例进行说明。
 
        rDNA 和rRNA中的小写字母"r"是ribosome(核糖体)的缩写。rDNA指的是基因组中编码核糖体RNA(rRNA)分子的对应的DNA序列,也就是编码16S rRNA的基因。rRNA指的是rDNA的转录产物,它是构成核糖体的重要成分,核糖体由许多小的rRNA分子组装而成,16S rRNA是其中一个组件。一般所分析的对象都是16s rDNA,因为DNA提取容易,也比较稳定。
 
        在原核生物中,5S rRNA信息量少,不适合分析,23S rRNA虽然分子量大,但碱基突变速率要比16S rRNA快得多,对于较远的亲缘关系不适用。16S rRNA其大小在1,500 bp左右,所代表的信息量适中,因此是进行分类研究的理想材料。细菌16S rRNA在结构上含有高度保守的区域,也含有在不同菌种之间有差异的可变区。所以可以利用恒定区序列设计引物将16S rRNA片段扩增出来,利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类的鉴定。
 
        由于对16S基因序列的研究已较成熟,目前对于16S PCR产物已经有很多序列都是可以用的。所以一般对于不同的环境比如土壤、肠道等所用的PCR产物一般都是不同的,最好是用已有的发表的文献中的引物会更好一些。
  
2. 平台的比较及选择
平台的比较:
性能
HiSeq 2000
MiSeq
Roche 454
读长
2×100bp
2×150bp
360-550bp
数据量
~600G/Run
1.5-2G
~0.5G/Run
 
平台的选择:
a. HiSeq 2000 100PE读长为2×100bp,这个长度不足以为细菌分类提供很准确的结果的,因此目前应用该
    平台进行16S PCR产物测序所发表的文章很少。
b. MiSeq平台目前能提供的最长读长为2×250bp(总读长是500bp),但是长度超过150bp的碱基的质量值
    非常低,大部分不可用,所以实际上能得到质量值保证的读长是2×150bp。由于PCR产物样本的单一性
    及低复杂度,需要在16S PCR产物测序中加入50%的PhiX对照,因此实际获得的有效数据量为0.75-
    1G/Run。
c. 由于Amplicon测序中ghost well效应的存在,454 平台进行16S PCR产物测序的数据产出略低于正常样
    本,每个Run的数据产量为0.3-0.4G,reads条数是720,000 – 1,040,000条,平均读长是400bp。1/2run
    的数据产量是0.15-0.2G,reads条数是360,000-520,000条。目前绝大部分已发表的16S PCR产物测序
    相关文章都是应用454平台测序的。因此,对于PCR产物高通量测序一般建议使用454平台。
 
3. 项目流程
        主要的思路是将待测的样本同时加上测序引物,并且每个样本都带上特异的序列标签(MID),测序后根据标签序列区分不同样本的序列。
4. 信息分析
a. 基本信息分析
    按标准流程进行base calling、raw data数据整理及数据质量评估。
b. 标准信息分析
    根据MID区分并整理不同样品的序列;
    物种组成分析(与RDP、Silva、GreenGene等数据库比对);
    alpha及beta多样性统计(软件Mothur、QIIME等);
    群落组成与理化参数之间的相关性分析(ABT、MRT等)。
c. 高级信息分析
    根据客户的具体研究进行的个性化分析。

添加时间:

2013年01月29日

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