如何通过RNA-Seq了解转录本的结构

测序转录组的方法可不止一种。一些研究人员的目标是计数转录本,评估表达水平,则测序可代替DNA芯片。而另一些研究人员感兴趣的是转录本的结构。真核生物的基因常常经过选择性剪接,是否包含特定的外显子,这有着深远的生物学影响。

前一个应用比较简单,也更加广泛。它与Illumina测序平台的特征相吻合,这些平台提供了短的RNA序列,但每次有数十亿个。而对于后一个阵营的研究人员而言,生物信息学工具和长读取计数才是问题的关键。

Pacific Biosciences的首席科学官Jonas Korlach介绍,哺乳动物的转录本大约在1,0003,000个碱基,并以多种形式存在。例如,一个基因有5个外显子,则可能出现各种配置,如1234512451345245等等。弄清这些不同形式的结构和丰度应该不是什么难事,只要测序每个RNA分子并计算其数量。然而,问题在于目前的测序技术无法做到这一点。

IlluminaHiSeq v4试剂每次运行大约产生40亿个高度准确的读取,这对转录组测序而言是足够了。然而,每个双端读取的长度在2 x 125 bp,这就难以确定哪些片段是在一起的。如果这些读取中包含重复元件,则很难定位到基因组中。

斯坦福大学遗传学教授Michael Snyder在接受采访时表示:你仔细想想,我们研究转录组的方式是疯狂的。我们得到RNA,将其炸成碎片,然后又尝试将它们组合回去,了解转录组一开始是个什么样子。这是一种可怕的方式。

Pacific Biosciences的单分子测序系统PacBio RS II产生了平均长度在8,500 bp的读取,这足以覆盖大多数的转录本。但RS II的每个SMRT Cell只产生50,00080,000个读取,这对于全面读取每个转录本而言还是太少。对于许多研究人员来说,两全的解决方案就是将两种方法相结合。

在最近一项发表于PNAS上的研究中,Snyder的研究团队采用混合策略,利用PacBio的长读取和Illumina的短数据来测序一位儿童及其父母的淋巴母细胞转录组。同时,Illumina的读取也能用来检查PacBio碱基检出的错误[1]

华盛顿大学西北基因组中心的技术开发主任Jason Underwood也在H1人胚胎干细胞系的转录组分析中采用了这种策略[2]。他们的混合测序(hybrid sequencing方法鉴定出H1细胞中表达的数百个新基因/长链非编码RNAlncRNA)以及数千个已知基因的异构体。

不过,Underwood并不总是利用短读取来进行错误校正,在分析鸡的转录组结构时,他只使用了长读取技术[3]。他利用SMRT测序来产生鸡胚胎心脏的全长cDNA,鉴定出9,000多个新颖的转录异构体,以及Ensembl注释中未包含的500多个基因。

Korlach介绍,PacBio的技术让研究人员能捕获全部的转录本多样性。在这种称为Iso-Seq的方法中,用户合成cDNA并筛分,创建出不同长度的文库,然后环化并测序。PacBioSMRT分析软件对相同结构的转录本进行聚类,从而最大限度减少测序错误。互补的策略是环化测序(circular consensus sequencingCCS),其中cDNA被环化并反复测序,以产生更加准确的平均读取。

鉴于PacBio的读取次数相对较低,一些研究人员将这种技术与选择一些基因的方法相结合。在一项最新的研究中,瑞士巴塞尔大学Peter Scheiffele领导的研究团队利用PacBio方法,对成年小鼠大脑中的370,000个轴突蛋白转录本进行测序,鉴定出这个家族中近1,400个独特的异构体[4]

为了理解那些数据,Scheiffele的团队使用了一种称为GMAP的算法程序,这也是Underwood使用的。分析转录本结构的其他生物信息学工具包括CufflinksSpliceMap SigFugeSigFuge由北卡罗来纳大学教堂山分校D. Neil Hayes副教授的实验室开发,是一种鉴定有趣的结构变异的工具。Hayes则使用它来鉴定数千个患者样本中的癌症标志物。如果变异很重要,那么它应当是经常性的,他解释道。有了SigFuge我们能够检测RNA结构中经常性的结构变异。

但是你需要多少序列才能找到它们呢?Hayes认为没有简单的答案。一般来说,越多越好。但是你测序越多,研究就越昂贵。他认为每个肿瘤转录组需要6000万个Illumina读取。

作为一般准则,Underwood建议对全转录组分析感兴趣的用户至少分析每个样品的100万个读取。最低和最高表达的RNA之间可能相差56个数量级,他说。因此,即使是最稀有的转录本,100万个读取应该也够了。这大约需要PacBio仪器上的20SMRT cell,或每次运行8cell2.5次运行。(Jeffrey M. Perkel

参考文献

[1] Tilgner, H, et al., “Defining a personal, allele-specific, and single-molecule long-read transcriptome,” Proc Natl Acad Sci USA, 111:9869-74, 2014. [PubMed ID: 24961374]

[2] Au, KF, et al., “Characterization of the human ESC transcriptome by hybrid sequencing,” Proc Natl Acad Sci USA, 110:E4821–30, published online November 26, 2013, doi: 10.1073/pnas.1320101110. [PubMed ID: 24282307]

[3] Thomas, S, et al., “Long-read sequencing of chicken transcripts and identification of new transcript isoforms,” PLoS ONE, 9:e94650, 2014. [PubMed ID: 24736250]

[4] Schreiner, D, et al., “Targeted combinatorial alternative splicing generates brain region-specific repertoires of neurexins,” Neuron, in press, 2014. [DOI: 10.1016/j.neuron.2014.09.011]

添加时间:

2014年12月26日

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